Giai đoạn đầu

Cambiasso bắt đầu sự nghiệp chơi bóng chuyên nghiệp cho câu lạc bộ Argentinos Juniors vào năm 1995, chuyển tới đội B của Real Madrid vào năm 1996.

Vào năm 1998, anh chuyển lại về Argentina nơi anh chơi trong 3 năm cùng Independiente và một năm cùng River Plate. Với một số kinh nghiệm tích luỹ được, anh trở lại Real Madrid vảo năm 2002. Anh giúp Los Blancos giành Siêu cúp bóng đá châu Âu vào năm 2002,La Liga và Intercontinental Cup vào năm 2003, và Siêu cúp bóng đá Tây Ban Nha vào năm 2003.

Inter Milan

Vào tháng 7 năm 2004, Cambiasso ký hợp đồng cùng Internazionale sau khi hợp đồng của anh cùng Real Madrid hết hạn vào tháng 6 năm 2004. Anh giúp Inter Milan vô địch cúp bóng đá quốc gia Italia trong mùa giải đầu tiên cùng đội bóng, thường chơi ở vị trí tiền vệ trụ, đối tác của anh ở vị trí này là một cầu thủ người Argentina khác: Juan Sebastián Verón. Ở Ý, anh trở thành một trong những cầu thủ nổi bật ở mùa giải 2004-05 cùng Kaká của AC Milan.

Trong trận chung kết lượt về Coppa Italia 2006, Cambiasso ghi một bàn thắng tuyệt đẹp để mở tỉ số trận đấu và đóng góp vào chiến thắng 3-1 trước A.S. Roma. Vào ngay 30 tháng 9 năm 2006, anh ghi 2 bàn trong trận mở màn mùa giải khi Inter đánh bại ACF Fiorentina 3-2. Vào ngày 7 tháng 11 năm 2007, anh cùng Zlatan Ibrahimović mỗi người ghi 2 bàn trong chiến thắng 4-2 trước PFC CSKA Moscow ở cúp C1. Vào ngày 23 tháng 3 năm 2009, Inter cùng Cambiasso ký hợp đồng mới có thời hạn đến năm 2014.

Trong năm mùa giải cùng Inter, Cambiasso chứng minh bản thân như là cầu thủ chủ chốt của đội bóng, và cũng trở thành một trong những tiền vệ hay nhất Serie A. Nhiều fan Inter mong muốn anh trở thành người kế thừa chiếc băng đội trưởng của đội bóng từ tay Javier Zanetti.

Ngày 8 tháng 9 năm 2017, Cambiasso chính thức giã từ sự nghiệp thi đấu quốc tế sau 22 năm thi đấu chuyên nghiệp.